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利用离心机对酵母核糖核酸进行分离和鉴定

2022/3/29 22:03:50      点击:
一、 实验目的

1、掌握酵母RNA提取的方法。

2、了解核酸的组成。

3、掌握鉴定核酸组分的方法和操作。

二、 实验原理

酵母核酸中RNA含量较多,DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液,当碱被中和后,可加乙醇使其沉淀,由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分,加入硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在(见实验内容)

三、 实验步骤

1、 用托盘天平称1g干酵母于研钵中,加入少许石英砂,再加入2ml 0.04mol/LNaOH溶液,在研钵中充分研磨至少5min。

2、 再加4ml 0.04mol/LNaOH溶液于匀浆液中,混匀后,将匀浆液转移到大试管中,再用4ml 0.04mol/LNaOH溶液洗涤研钵,洗涤液并入匀浆液中。

3、 将大试管小心在沸水浴中加热30min,冷却后倒入离心管中,与另一组离心管在托盘天平上平衡,然后两组的离心管对称地放入离心机中,2000r/min下离心15min。

4、 吸取10ml酸性乙醇溶液于小烧杯中,将离心管上清液小心倒入小烧杯中,边倒入边搅拌,直到RNA沉淀完全。

5、 将小烧杯中的液体倒入2个干净的离心管,平衡、离心(2000r/min)3min。

6、 弃去两离心管上清液,各离心管中加入95%乙醇2.5ml,振荡、混匀、平衡、离心(2000r/min)3min。

7、 弃去两离心管上清液,各离心管加入3ml 1.5mol/L硫酸,混匀、倒入同一个大试管中,贴上标签,放在试管架上,备用。

8、 将水解液在沸水浴中加热至少10min,使沉淀RNA充分水解。

9、 取一支试管A,加入1ml 0.1mol/L硝酸银溶液,再逐滴加入浓氨水至沉淀消失,然后加入1ml水解液放置片刻,观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀。

10、 另取一支试管B,加入水解液1ml,三氯化铁浓盐酸溶液2ml和地衣酚乙醇溶液0.2ml(约4滴),混匀,用试管夹夹好后放到沸水浴中3~5min,注意观察溶液是否变成绿色,说明核糖的存在。

11、 再取一支试管C,加入水解液1ml和定磷试剂1ml,混匀,在沸水浴中加热,注意观察溶液颜色的变化,溶液变蓝,说明磷酸存在。

注意事项:离心管一定要平衡对称放入离心机中,离心机达到设置转速时才能离开。


四、 实验结果

第6步中离心管底部有不少的RNA沉淀。

试管A:出现白色浑浊现象。有嘌呤碱存在。

试管B:加热后,出现鲜绿色,且随着加热时间延长,颜色越来越深。有核糖存在。

试管C:加热后,出现蓝色,且随着加热时间延长,颜色越来越深。有磷酸存在。

说明RNA的组分中有嘌呤碱、核糖、磷酸。

分析:

本实验选用酵母,是因为酵母中RNA含量较多,且价格便宜。RNA可溶于碱性溶液,所以本实验用0.04mol/LNaOH溶液来提取。RNA不溶于乙醇,可用酸性乙醇使RNA从溶液中沉淀出来,再用乙醇洗涤沉淀,可得到RNA粗制品。

研磨和NaOH使酵母细胞破裂,RNA主要存在于细胞质中,所以RNA被释放出来,同时,NaOH使蛋白质变性。

加入酸性乙醇,一方面可以中和NaOH,另一方面,使RNA从溶液中沉淀下来。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分,加入硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在。

(1)强酸使核酸分子的有机磷消化为无机磷,使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵(黄色沉淀)
PO43- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ ===(NH4)3PO4.12MoO3.6H2O + 6H2O

当有还原剂(如维生素C)存在时,Mo6+被还原成Mo4+,再与试剂中的其它MoO42-结合成Mo(MoO4)2,呈蓝色,称钼蓝。所以试管C中会出现蓝色。

(2)RNA与硫酸共热,生成的核糖进而脱水转化为糠醛,三氯化铁作为催化剂,可与地衣酚反应,生成绿色化合物,所以试管B中出现绿色。(OR苔黑酚)

(3)嘌呤碱可与硝酸银反应产生白色的飘零银化合物沉淀。所以试管A中出现浑浊现象。

(4)不检测嘧啶碱,是因为与嘌呤碱相比,它难以被水解下来,同时它难检测且现象不明显。

扩展资料:

酵母核酸提取原理

提取和制备RNA 的首要问题是选RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸的原料,其中RNA 的提制以酵母最为理想,因为酵母核酸中主要是RNA(2.67~10.0%),DNA 很少(0.03~0.516%),而且菌体容易收集,RNA 也易于分离。

RNA 提制过程首先要使RNA 从细胞中释放,并使它和蛋白质分离,然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质,将pH 调至2.0~2.5,使RNA 沉淀,进行离心收集。然后运用RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性,以乙醇洗涤RNA 沉淀。

提取RNA 的方法很多,在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。浓盐法是在加热的条件下,利用高浓度的盐改变细胞膜的透性,使RNA 释放出来,此法易掌握,产品颜色较好。

使用浓盐法提出RNA 时应注意掌握温度,避免在20~70℃之间停留时间过长,因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围,会使RNA 因降解而降低提取率。在90~100℃条件下加热可使蛋白质变性,破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶,有利于RNA 的提取。
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