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实验室离心机提取大肠杆菌质粒DNA的步骤

2016/12/1 17:45:55      点击:

质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术,但提取方法有很多种,以下介绍一种最常用的方法:

碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。

7、以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管

8、加入等体积的异戊醇,混匀后于0℃静置10min。

9、再以10,000rpm离心20min,弃上清。

10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中。

煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中,涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。

3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。

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